发布时间：2021-06-29 热度：

   

     生物负载控制是生物制药厂商以及行业供应商都非常关注的领域。本白皮书列举了下游生物工艺的一些相关风险，并介绍了最新供应商研发动态将如何帮助厂商减轻这些风险。本文涉及的主题包括原料质量、设备设计、层析填料性能以及生产方式的改进。还讨论了与蛋白A层析填料消毒具体相关的挑战。

生物制药生产中的生物负载控制

在大多数生物制药生产场景中，都存在着微生物污染的风险。上游工艺的条件（如受控的温度和营养丰富的培养基）不仅促进靶细胞的生长，也有利于其他微生物的生长。

下游工艺也同样面临着同样的挑战，可能会使用敞开的容器转移产品或处理缓冲液，也可引入与产品接触的原料和工艺助剂，如层析填料和缓冲液成分。在不同房间之间转移设备，会使工艺过程受到污染。层析等单元操作经常涉及大量的人工操作，例如填料浆料制备和层析柱填充。成功很大程度上取决于人员的技能和经验。而只要有人为干预，就会产生潜在的生物负载来源。

在本白皮书中，我们将以下游生物工艺为侧重点，讨论与生物负载相关的机遇与挑战。

生物负载的潜在影响

由于生物负载对公共卫生的潜在影响，监管机构制定了有关生物负载控制的高标准 (1,2,3)。这方面的问题不仅涉及产品被微生物污染的风险，还涉及其释放的毒素产生的影响，以及对产品稳定性和效能的潜在影响。除了对患者的潜在不良影响外，因生物负载事件导致批次失败造成的经济影响也是巨大的。对于单克隆抗体(mAb)这种畅销药，停产一个月将损失多达 10亿美元的收入，并且根本原因的调查和生产设施的消毒处理也会产生巨额成本（表 1）。因患者诉讼和长期声誉受损而导致的损失更是难以估计的巨大损失。

解决生物负载挑战需要药品生产商保持警惕，但行业的供应商也责任重大。这包括原料质量保证、新的生产方式以及产品创新，以满足高卫生标准或确保更好的消毒效果。本白皮书回顾了近年来在生物负载控制领域的一些成果。

表1.生物制药生产中生物负载事件的潜在影响和成本

了解生物负载

潜在的微生物污染物有多种存在形式，包括细菌、病毒和霉菌。此外，还存在外毒素或内毒素污染的风险。

了解这些潜在污染物的性质可以帮助我们规避风险。了解这些情况后，氢氧化钠(NaOH)成为了许多重复使用的工艺组件的首选清洁剂和消毒剂。然而，使用 NaOH 存在着一些挑战。例如，一些可重复使用的材料无法耐受高浓度的 NaOH。而且，诸如革兰氏阳性枯草杆菌的产芽孢厌氧菌很难去除，因为它们可以耐受高浓度的 NaOH。残留的芽孢可在之后的有利条件下繁殖，例如在重新平衡层析柱以及将富集收获的材料装载到层析柱的过程中。

内毒素是一种与革兰氏阴性菌（如布鲁氏菌、奈瑟氏菌和弧菌，以及埃希氏大肠杆菌）外膜相关联的耐热脂多糖。当细菌细胞遭到破坏时，内毒素被释放。大量的内毒素会导致出血性休克和严重腹泻。少量内毒素会引起发烧、对细菌感染的抵抗力改变、白细胞先减少后增多等其他生物效应。通常使用氢氧化钠溶液 (>0.1 M) 灭活内毒素。

外毒素是某些革兰氏阳性或革兰氏阴性菌产生的一种具有可溶性、抗原的且通常不耐热的有害物质。它们在细菌细胞内形成，但被释放到周围环境中，且具有很高的效能。大多数外毒素是蛋白质，其分子量范围非常广。外毒素分子的毒性作用会因受热、长时间储存或化学物质而被破坏，形成类毒素物质。也有基于肽的外毒素，它们往往具有更高的耐受力。

繁殖体是指那些正在生长和繁殖而未休眠或形成芽孢的细菌或微生物。繁殖体可通过一系列程序除去，包括过滤、加热以及用各种化学试剂处理。

产芽孢细菌可产生芽孢，让微生物能够在不利的环境条件中生存下来。细菌芽孢由细胞外一层坚硬的角蛋白构成，耐化学品、抗染色和耐热。芽孢可使细菌休眠数年。这样可以保护细菌免受各种伤害，包括温度差异以及空气、水和营养物质匮乏。当条件变得适宜时，它们能够转化为营养态并繁殖。产芽孢细菌会引起多种疾病，包括肉毒中毒、炭疽、破伤风和急性食物中毒。芽孢很难去除，但易受 121°C 以上温度以及氧化剂（如次氯酸钠和过乙酸溶液）的影响。

病毒是在其他生物（包括动物、植物和细菌）细胞内复制的病原体。通常，病毒颗粒比细菌小得多，由被蛋白衣壳包围的核酸核组成。一些病毒颗粒还有一层脂质包膜，使其易被溶剂和清洁剂去除。大多数病毒颗粒可以通过过滤去除，但较小的病毒（如细小病毒）则较难去除。病毒可引起多种人类疾病，从普通感冒和流行性感冒，到艾滋病和埃博拉，都是病毒引起的疾病。

图1.生物制造中的生物负载来源。改编自参考文献4。

生物负载的来源

细菌、真菌和病毒存在于水、土壤、空气、植物、动物和人体中。它们可通过许多途径进入工艺流程。生物负载控制包括防止此类污染物进入生产工艺的措施、将其从产品中去除的工艺步骤（例如过滤、层析分离、低 pH 灭活、溶剂-清洁剂处理）以及消毒等。

作为工艺经理，您会担心产品整个生命周期中的生物负载，从设计生产工艺和新设施，到供货多年后生产最后一批商品。您可能有许多种可供选择的替代方案，也可能因为工厂的基础设施现状而只能进行微小的调整和变更。如果您现在从头开始设计工艺，那么这是一个非常重要的机会，您应当在设施和工艺设计中采取策略，以帮助避免潜在的生物负载来源（图 1）。

许多考虑因素取决于设施的设计。显然，将工艺改造到一座既有建筑物中，会带来很多限制。此外，建造新设施的方法也大不相同，例如，有些设计采用多房间结构，有些则以一个大房间为主。可选择预制单元，也可以采用较为传统的施工方法（图 2）。

图2.预制的KUBio™设施主要使用一次性技术来生产mAb。

解决生物负载的方案

生产设施中的生物负载将在很大程度上取决于设备的选择——根本原因在于使用一次性材料还是不锈钢，但也与详细的设计特征有关。这将对污染风险、清洁和消毒的需求以及消毒设施的范围和规模产生影响。处理设备的程序需要解决特定的生物负载问题，并且员工需要接受适当的培训以减少风险。工艺监测还引入了重要的潜在微生物污染途径，在选择设备或制定规程和培训人员时需要考虑这些潜在途径。

工艺设计（包括所涉及的单元操作的类型）将影响封闭系统、一次性设备和自动化的使用程度。包括过滤器、层析填料和缓冲液成分在内的原料是微生物污染的其他潜在来源，工艺用水和流入设施的气流等公用设施也是如此。最后，生产设施中的人员也构成了重大的生物负载风险，须通过规程（如穿无菌服）、培训、使用封闭系统和自动化来解决(5)。

生物负载控制涉及的范围非常广，其重要性绝不能排在其他的生产问题之后。药品生产商及其供应商应优先考虑并解决生物负载的问题，并进行持续沟通，以确保相互了解情况、风险和能力。

原料

在生产过程中与产品分子直接接触的原料和工艺助剂是潜在的微生物污染源。层析填料显然属于此类，供应商的适当质量保证措施有助于控制这方面的污染。通常，生物制药生产商会对供应商进行质量审计，因此，这些质量审计会将成为解决质量问题的理想方式。

30多年来，Cytiva的填料生产一直是客户定期进行质量审计的对象。生物负载一直是经常讨论的主题，已引发了一系列的改进，包括改善清洁方法、广泛培训操作员、定期监测工艺用水、改进在筛分和灌注区域中对微生物和颗粒的监测、缩短保存时间以及减少开放性程序。

这些改进带来了非常令人鼓舞的质量控制检测结果。例如，在 2010 年 1 月至 2017 年 5 月之间放行的 MabSelect SuRe™填料批次中，有 94％的批次未检出生物负载（图 3）。

图3.生物负载控制对层析填料微生物检测结果的影响。

近期，所选蛋白A填料和Capto™填料的微生物指标从小于100个集落形成单位 (CFU)/mL 降至小于20个CFU/mL，降幅达五倍。此外，还引入了内毒素指标（< 5 个内毒素单位 (EU)/mL）。

生产工艺中的生物负载预防

一次性解决方案

一次性解决方案的引入在许多方面简化了生物负载控制，至少在较小的规模上是如此。一次性预包装产品通常在交付前都经过了预先消毒处理。现在，由于产品、生产规模和单元操作会随着时间的推移而改变，细胞培养已经可以在袋中进行，而上游和下游操作也可以在同一个负载控制严格、灵活性和适应性强的“开放式”设施中进行 (6)。

层析柱操作和封闭式处理

另一项对生物负载控制有着积极影响的发展是自动化。例如，现在已出现了可完成层析柱填充、操作和卸料这三项艰巨任务的自动化解决方案 (5)。自动化使整个工艺变得不那么“手动”，重现性提高，并且除了最初从运输容器中转移填料外，基本上都是封闭操作（图 4）。自动化的层析柱处理与创新性的设计功能相结合，实现高水平的卫生标准。

图4.在封闭系统中填充层析柱意味着最大程度地减少填料和缓冲液的手动操作。这可以通过在一个封闭系统（蓝框）中连接层析柱、匀浆罐和层析设备来实现。