发布时间：2021-06-08 热度：

　　首先我们来看一下CCK8与MTT的实验原理。

　　CCK-8实验：

　　实验原理：

　　全称为Cell Counting Kit-8，在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被细胞内脱氢酶还原成水溶性的甲臜染料，生成的（橙黄色）甲臜量与活细胞数量成正比，即颜色的深浅与细胞的增值成正比。因此可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

　　注意事项：

　　1、酚红和血清对CCK-8法的检测不会造成干扰，可以通过减去空白孔中本底的吸光度而消除。

　　2、CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。

　　3、当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔容易干燥挥发，导致体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。

　　4、金属对CCK-8显色有影响：终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会5%、15%、90%的抑制显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10mM，将会100%抑制显色反应。

　　5、部分悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量并延长培养时间。

　　实验原理：

　　全称为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝，是一种接受氢离子的黄颜色染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。

　　国科质检建议注意事项：

　　1、在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT吸光度最好在0-0.7范围内。

　　2、MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20℃长期保存，避免反复冻融

　　3、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

　　4、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。